Toksisitas Akut Dengan BSLT ( Brine Shrimp
Letality Test )
I.
Tujuan
- Terampil dalam melakukan uji toksisitas akut dengan menggunakan metode BSLT
- Mengetahui cara perhitungan LD50 dengan metode BSLT
- Mampu melaksanakan pengujian toksisitas secara in vitro dengan menggunakan metode BSLT
- Mampu menetapkan LC50 sebagai parameter ketoksisan akut berdasarkan analisa probit.
II.
Landasan
Teori
Toksisitas dari suatu senyawa secara umum dapat
diartikan kepada potensi dari suatu senyawa kimia untuk dapat menyebabkan
kerusakan ketika senyawa tersebut mengenai
atau masuk kedalam tubuh manusia. Suatu senyawa kimia dikatakan bersifat
racun akut jika senyawa tersebut dapat menimbulkan efek racun dalam jangka
waktu yang singkat, dan bersifat kronis jika senyawa tersebut dapat menimbulkan
efek racun dalam jangka waktu yang panjang (karena kontak yang berulang-ulang
walaupun dalam jumlah yang sedikit).
Pengetahuan mengenai toksisitas suatu bahan kimia
disimpulkan dengan mempelajari efek-efek dari pemaparan bahan kimia terhadap
hewan percobaan, pemaparan bahan kimia terhadap organism tingkat rendah seperti
bakteri dan kultur sel-sel dari mamalia di laboratorium dan pemaparan bahan
kimia terhadap manusia.
Untuk skrining dan fraksionasi fisiologi aktif dari
ekstrak tanaman dapat di lakukan uji standar toksisitas akut (jangka pendek).
Suatu metode yang digunakan secara luas dalam penelitian bahan alam untuk
maksud tersebut adalah adalah Brine Shrimp Lethality Test (BSLT). BSLT
merupakan salah satu cara yang cepat dan murah untuk uji aktifitas farmakologi
dari ekstrak tanaman dengan menggunakan hewan laut yaitu larva udang Artemia
salina Leach. Uji ini mengamati mortalitas larva udang yang di sebabkan oleh
senyawa uji. Senyawa yang aktif akan menghasilkan mortalitas yang tinggi.
Uji toksisitas dengan metode BSLT ini memiliki spectrum
aktifitas farmakologi yang luas, prosedurnya sederhana, cepat dan tidak
membutuhkan biaya yang besar, serta hasilnya dapat di percaya. Disamping itu
metode ini sering dikaitkan dengan
metode penapiasan senyawa antikanker. Dengan alas an-alasan tersebut, maka uji
ini sangat tepat digunakan dalam penelitian bahan alam.
Peranan antioksidan sangat penting dalam
meredam efek radikal bebas yang berkaitan erat dengan terjadinya penyakit
degeneratif seperti tekanan darah tinggi, jantung koroner, diabetes dan kanker
yang didasari oleh proses biokimiawi dalam tubuh. Radikal bebas yang dihasilkan
secara terus menerus selama proses metabolisme normal, dianggap sebagai
penyebab terjadinya kerusakan fungsi sel-sel tubuh yang akhirnya menjadi pemicu
timbulnya penyakit degeneratif. Reaksi radikal bebas secara umum dapat dihambat
oleh antioksidan tertentu baik alami maupun sintetis. Sebahagian besar
antioksidan alami berasal dari tanaman, antara lain berupa senyawaan tokoferol,
karatenoid, asam askorbat, fenol, dan flavonoid.
Senyawa bioaktif hampir selalu toksik
pada dosis tinggi, oleh karena itu daya bunuh in vivo dari senyawa
terhadap organisme hewan dapat digunakan untuk menapis ekstrak tumbuhan yang
mempunyai bioaktivitas dan juga memonitor fraksi bioaktif selama fraksinasi dan
pemurnian. Salah satu organisme yang sesuai untuk hewan uji adalah brine
shrimp (udang laut).
Untuk mengetahui toksisitas ekstrak daun dalam penelitian ini digunakan metode BSLT (Brine Shrimp Lethality
Test) dan untuk mengetahui aktivitas ekstrak daun sebagai antioksidan digunakan metode DPPH
(-1,1-difenil-2-pikrilhidrazil). Pengukuran antioksidan secara ‘Efek peredaman
radikal bebas DPPH’ merupakan metode pengukuran antioksidan yang sederhana,
cepat dan tidak membutuhkan banyak reagen seperti halnya uji lain
(xantin-xantin oksidase, metode Tiosianat, antioksidan total). Hasil pengukuran
menunjukkan kemampuan antioksidan sampel secara umum tidak berdasar jenis
radikal yang dihambat. Pada metode ini, DPPH berperan sebagai radikal bebas
yang diredam oleh antioksidan dari bahan uji, dimana DPPH akan bereaksi dengan
antioksidan tersebut membentuk 1,1,-difenil-2- pikril hidrazin. Reaksi ini
menyebabkan terjadinya perubahan warna yang dapat diukur dengan spektrofotometer
sinar tampak pada λ515 nm, sehingga aktivitas peredaman radikal bebas oleh
sampel dapat ditentukan.
Uji Toksisitas dengan Metode BSLT. Metode Meyer et al. digunakan untuk mempelajari toksisitas sampel
secara umum dengan menggunakan telur udang (Artemia salina Leach). Penetasan
Larva Udang, disiapkan bejana untuk penetasan telur udang. Di satu ruang
dalam bejana tersebut diletakkan lampu untuk menghangatkan suhu dalam
penetasan, sedangkan di ruang sebelahnya diberi air laut. Kedalam air laut dimasukkan
+ 50-100 mg telur udang untuk ditetaskan. Pada bagian telur ditutup dengan
aluminium foil, dan lampu dinyalakan selama 48 jam untuk menetaskan telur.
Diambil larva udang yang akan diuji dengan pipet.
Prosedur Uji Toksisitas dengan Metode
BSLT. Sebanyak 100 μL air laut yang mengandung
larva udang sebanyak 10-12 ekor dipipet, kemudian dimasukkan ke
dalam wadah uji. Di tambahkan larutan sampel yang akan diuji
masing-masing sebanyak 100 μL, dengan konsentrasi 10, 100, 200, 500 dan
1000 ppm. Untuk setiap konsentrasi dilakukan 3 kali pengulangan
(triplikat). Larutan diaduk sampai homogen. Untuk kontrol dilakukan
tanpa penambahan sampel. Larutan dibiarkan selama 24 jam, kemudian dihitung
jumlah larva yang mati dan masih hidup dari tiap lubang. Angka mati
dihitung dengan menjumlahkan larva yang mati dalam setiap konsentrasi (3
lubang). Angka hidup dihitung dengan menjumlahkan larva yang hidup
dalam setiap konsentrasi (3 lubang).Perhitungan akumulasi mati tiap
konsentrasi dilakukan dengan cara berikut: akumulasi mati untuk
konsentrasi 10 ppm = angka mati pada konsentrasi tersebut, akumulasi
mati untuk konsentrasi 100 ppm = angka mati pada konsentrasi 10
ppm + angka mati pada konsentrasi 100n ppm, akumulasi mati untuk
konsentrasi 200 ppm = angka mati pada konsentrasi 10 ppm + angka mati
pada konsentrasi 100 ppm + angka mati pada konsentrasi 200 ppm.
Akumulasi angka mati dihitung sampai konsentrasi 1000 ppm. Perhitungan
akumulasi hidup tiap konsentrasi dilakukan dengan cara berikut: akumulasi
hidup untuk konsentrasi 1000 ppm = angka hidup pada konsentrasi 1000
ppm, akumulasi hidup untuk konsentrasi 500 ppm = angka hidup pada konsentrasi
1000 ppm + angka hidup pada konsentrasi 500 ppm, akumulasi hidup untuk
konsentrasi 200 ppm = angka hidup pada konsentrasi 1000 ppm + angka
hidup pada konsentrasi 500 ppm + angka hidup pada konsentrasi 200 ppm.
Akumulasi angka hidup dihitung sampai konsentrasi 10 ppm.
Selanjutnya dihitung mortalitas dengan
cara: akumulasi mati dibagi jumlah akumulasi hidup dan mati (total)
dikali 100%. Grafik dibuat dengan log konsentrasi sebagai sumbu x
terhadap mortalitas sebagai sumbu y. Nilai LC50 merupakan konsentrasi dimana
zat menyebabkan kematian 50% yang diperoleh dengan memakai
persamaan regresi linier y = a + bx. Suatu zat dikatakan aktif atau
toksik bila nilai LC50 < 1000 ppm untuk ektrak dan < 30 ppm untuk suatu
senyawa.
III.
Alat
dan Bahan
- Kotak penetasan larva
- Mikro pipet 2-20 µL
- Mikro pipet 20-200 µL
- Wellplate
- Kaca pembesar
- Tabung reaksi
- Labu ukur
- kotak
- steroform
IV.
Prosedur
kerja
a.Penetasan larva
b.Orientasi
konsentrasi
V.
HASIL
PENGAMATAN
Analisis
data BSCT dengan analisis Probit
|
Kelas
|
Konsentrasi ppm
|
Log C (y)
|
Hidup
|
mati
|
% kematian
|
Probit
|
Lc 50
|
|
A
Ekstrak
BINTARO
|
10000
|
4
|
-
|
10
|
100
|
8,7190
|
-
|
|
1000
|
3
|
-
|
10
|
100
|
8,7190
|
||
|
100
|
2
|
-
|
10
|
100
|
8,7190
|
||
|
10
|
1
|
-
|
10
|
100
|
8,7190
|
||
|
1
|
0
|
-
|
10
|
100
|
8,7190
|
||
|
0,1
|
-1
|
-
|
10
|
100
|
8,7190
|
||
|
B
Ekstrak
Alpukat
|
10000
|
4
|
-
|
10
|
100
|
8,7190
|
26,4338
ppm
|
|
1000
|
3
|
1
|
9
|
90
|
6,2816
|
||
|
100
|
2
|
4
|
6
|
60
|
5,2533
|
||
|
10
|
1
|
5
|
5
|
50
|
5,000
|
||
|
1
|
0
|
2
|
8
|
80
|
5,8416
|
||
|
0,1
|
-1
|
3
|
7
|
70
|
5,5244
|
Ket :
Digunakan regresi linier
Y = a + bx
Probit
= a + b (log C)
a = 3,26715
b = 1,21853
r = 0,9271
di hitung LC 50 ?
LC
50 = (5-a)/b
LC
50 = (5-3,26715)/1,21853
LC 50 = 1,42216
Antilog
LC 50 = 26,4338 ppm
Analisis
data BSCT dengan analisis Reed-Munch
|
kelas
|
Konsentrasi ppm
|
hidup
|
mati
|
∑mati
|
∑ hidup
|
total
|
ratio
|
% kematian
|
LC 50
|
|
B
Ekstrak
Alpukat
|
0,1
|
11
|
19
|
19
|
45
|
64
|
19/64
|
29,68
|
0,6223 ppm
|
|
1
|
7
|
23
|
42
|
34
|
76
|
42/76
|
55,26
|
||
|
10
|
13
|
17
|
59
|
27
|
86
|
52/79
|
68,6
|
||
|
100
|
13
|
17
|
76
|
14
|
90
|
76/90
|
84,4
|
||
|
1000
|
1
|
29
|
105
|
1
|
106
|
105/106
|
99,0
|
||
|
10000
|
0
|
30
|
135
|
0
|
135
|
135/135
|
100
|
Di hitung :
h=
50%-a/(b-a)
h
: ukuran jarak
a
: % yang menyebabkan kematian lebih kecil
dari 50 %
b
: % yang menyebabkan kematian lebih
besar dari 50 %
h
= (50%-29,68%)/(55,26%-29,68%)
Di hitung :
i
= log kematian diatas 50% / kematian dibawah 50%
i
: log kenaikan dosis
i
= log 1/0,1
i
= log 10
i
= 1
Di hitung :
g
= h X i
g
: hasil kali dari ukuran jarak dan log kenaikan dosis
g
= 0,749 X 1
g
= 0,749
DI hitung :
y
= g + log kematian lebih kecil dari 50 %
y
: hasil penjumlahan g dan log kematian kecil dari 50 %
y
= 0,749 + log 0,1
y
= 0,749 – 1
y
= - 0,206
LC 50 = anti log y
LC 50 = anti log – 0,206
LC 50 = 0,6223 ppm
Analisis
data BSCT dengan analisis Farmakope
|
kelas
|
Konsentrasi ppm
|
Log dosis
|
Hidup
|
Mati
|
∑ mati
|
Pi
|
∑ Pi
|
LC 50
|
|
B
Ekstrak
Alpukat
|
0,1
|
-1
|
11
|
19
|
63
|
0,63
|
4,47
|
1,071
ppm
|
|
1
|
0
|
7
|
23
|
76
|
0,76
|
|||
|
10
|
1
|
13
|
17
|
56
|
0,56
|
|||
|
100
|
2
|
13
|
17
|
56
|
0,56
|
|||
|
1000
|
3
|
1
|
29
|
96
|
0,96
|
|||
|
10000
|
4
|
0
|
30
|
100
|
100
|
Di hitung :
m
= a – b ( ∑ Pi – 0,5)
∑Pi : % kematian terhadap % seluruh hewan yang
dicobakan.
m
= 4 – 1 (4,47 – 0,5)
m
= 4 – 1 (3,97)
m
= 4 – 3,97
m
= 0,03
LC
50 = anti log m
LC
50 = anti log 0,03
LC
50 = 1,071 ppm
VI.
Pembahasan
Uji BSLT (Brine Shrimp Lethality Test)
merupakan uji toksisitas yang digunakan
sebagai uji permulaan untuk mengetahui aktivitas dari suatu zat atau senyawa
yang terkandung dalam suatu ekstrak atau suatu isolat murni.
Pada praktikum
kali ini larva udang yang digunakan adalah jenis Artemia salina yang telah berumur 48 jam dan proses pembenihan telur udang yang digunakan adalah sebanyak 0,5 gram dan dimasukkan dalam
air garam dengan kadar 38% (38 gram
dalam 1liter air) hal ini dilakukan sebagai simulasi dari habitat asli udang yaitu air laut.
Adapun ekstrak
yang digunakan adalah ekstrak buah alpukat dan bintaro yang dibuat larutan dengan konsentrasi yang berbeda-beda yaitu mulai dari 10000, 1000, 100, 10, 1 dan 0,1 ppm. Hal ini
bertujuan untuk mengetahui
LC50 dari
masing - masing ekstrak tersebut dengan berbagai konsentrasi.
Pada prakteknya
dengan perlakuan yang sama yaitu larutan
ekstrak yang dimasukkan dalam tabung reaksi yang berisi 10 buah larva dengan 10 ml
larutan (9 ml air garam dan
ekstrak sebanyak 1 ml).
Ekstrak bintaro menunjukkan hasil data yang error, hal ini ditunjukkan dengan
adanya kematian pada semua larva udang di berbagai konsentrasi. Adapun untuk
ekstrak alpukat menunjukkan hasil bahwa dengan naiknya konsentrasi maka larva
udang yang mati semakin banyak, tetapi pada konsentrasi 1 dan 0,1 ppm tidak
menunjukkan hal denmikian, sehingga data yang dipakai adalah pada konsentrasi
10000 sampai 100 ppm. Selain itu percobaan
dilakukan triplo agar didapat data statistik yang baik sehingga, dapat dihitung secara statistik dari data tersebut.
Dalam
penentuan nilai LC50 ini dapat dilakukan
dengan 3 cara/metode, yaitu :
1. Perhitungan
probit
2.
analisis
Reed-Munch
3. analisis
Farmakope
Dalam perhitungan
dengan metode analisis probit, diperlukan tabel probit dan rumus regresi
liniear untuk menentukan nilai a, b dan r. Kemudian dimasukkan dalam rumus X50
= (b-a)/b dan kemudian dapat ditentukan nilai LC50.
Adapun hasil perhitungan dengan menggunakan metode ini menunjukkan hasil bahwa
LC50 adalah 26,438
ppm.
Sedangkan dalam perhitungan dengan metode analisis
Reed-Munch sebelumnya harus diketahui jumlah larva yang mati dan hidup. Yang kemudian
dihitung ukuran jarak (h) = (50%-a)/(b-a) , kenaikan dosis (i) = log kematian diatas 50 %/kematian dibawah 50% , nilai (g) = h X I , nilai (y) = g + log
kematian lebih kecil dari 50 %, kemudian dapat ditentukan bahwa:
nilai LC 50 = anti log y
Dengan menggunakan metode analisis Reed-Munch didapatkan
hasil LC50 sebesar 22,54 ppm.
Perhitungan
data BSLT dengan metode yang ketiga yaitu dengan analisis Farmakope. Terlebih
dahulu dicari nilai Pi dan sigma Pi untuk selanjutnya dimasukkan dalam rumus :
m = a – b ( ∑
Pi – 0,5) → ∑Pi = % kematian terhadap % seluruh
hewan yang dicobakan
a = dosis terendah yang dapat menyebabkan kematian 100%
b = beda log dosis yang berurutan
selanjutnya dapat ditentukan nilai LC 50 = anti
log m. Dari hasil perhitungan didapatkan nilai LC50 sebesar 26,3 ppm.
Dari ketiga metode tersebut dapat diketahui bahwa didapatkan
LC50 dengan perbedaan yang tak terlalu jauh yaitu 26,438 ppm, 22,54
ppm, dan 22,54 ppm sehingga hal ini menunjukkan bahwa ekstrak biji alpukat
bersifat toksik terhadap larva udang karena LC 50 ≥ 1000 µg/mL,
sedangkan suatu ekstrak dikatakan aktif apabila mempunyai LC 50 ≤
1000 µg/mL.
VII.
Kesimpulan
Berdasarkan hasil
percobaan yang telah dilakukan :
1. Semakin tinggi konsentrasi ekstrak
semakin banyak larva udang yang mati.
2.
Nilai LC50
pada metode perhitungan analisis probit
adalah 26,438 ppm,
pada analisis Reed-Munch nilai LC50
adalah 26,438 ppm,
dan pada analisis farmakope nilai
LC50 adalah 26,3 ppm.
3. Ekstrak biji bintaro tidak dapat dihitung LC50 nya karena pada berbagai konsentrasi
larva udang mati semua.
VIII.
Daftar Pustaka
Anonim. 2000. Informatorium
Obat Nasional Indonesia. Depkes RI : Jakarta
Anief, Moh. 2000. Ilmu
Meracik Obat. Gadjah Mada University Press : Yogyakarta
Anonim. 1995. Farmakope Indonesia Edisi IV. Depkes RI
: Jakarta
Ansel, Howard.C.
1989. Pengantar Bentuk Sediaan Farmasi.
Universitas Indonesia Press : Jakarta
Ernst Mutschler, 1986, Dinamika Obat ; Farmakologi dan Toksikologi (terjemahan),
ITB, Bandung
