Yunietha Lakhiafa

Toksisitas Akut Dengan BSLT ( Brine Shrimp Letality Test )

I.               Tujuan
  • Terampil dalam melakukan uji toksisitas akut dengan menggunakan metode BSLT
  • Mengetahui cara perhitungan LD50 dengan metode BSLT
  • Mampu melaksanakan pengujian toksisitas secara in vitro dengan menggunakan metode BSLT
  • Mampu menetapkan LC50 sebagai parameter ketoksisan akut berdasarkan analisa probit.
II.             Landasan Teori
Toksisitas dari suatu senyawa secara umum dapat diartikan kepada potensi dari suatu senyawa kimia untuk dapat menyebabkan kerusakan ketika senyawa tersebut mengenai  atau masuk kedalam tubuh manusia. Suatu senyawa kimia dikatakan bersifat racun akut jika senyawa tersebut dapat menimbulkan efek racun dalam jangka waktu yang singkat, dan bersifat kronis jika senyawa tersebut dapat menimbulkan efek racun dalam jangka waktu yang panjang (karena kontak yang berulang-ulang walaupun dalam jumlah yang sedikit).
Pengetahuan mengenai toksisitas suatu bahan kimia disimpulkan dengan mempelajari efek-efek dari pemaparan bahan kimia terhadap hewan percobaan, pemaparan bahan kimia terhadap organism tingkat rendah seperti bakteri dan kultur sel-sel dari mamalia di laboratorium dan pemaparan bahan kimia terhadap manusia.
Untuk skrining dan fraksionasi fisiologi aktif dari ekstrak tanaman dapat di lakukan uji standar toksisitas akut (jangka pendek). Suatu metode yang digunakan secara luas dalam penelitian bahan alam untuk maksud tersebut adalah adalah Brine Shrimp Lethality Test (BSLT). BSLT merupakan salah satu cara yang cepat dan murah untuk uji aktifitas farmakologi dari ekstrak tanaman dengan menggunakan hewan laut yaitu larva udang Artemia salina Leach. Uji ini mengamati mortalitas larva udang yang di sebabkan oleh senyawa uji. Senyawa yang aktif akan menghasilkan mortalitas yang tinggi.
Uji toksisitas dengan metode BSLT ini memiliki spectrum aktifitas farmakologi yang luas, prosedurnya sederhana, cepat dan tidak membutuhkan biaya yang besar, serta hasilnya dapat di percaya. Disamping itu metode ini sering dikaitkan  dengan metode penapiasan senyawa antikanker. Dengan alas an-alasan tersebut, maka uji ini sangat tepat digunakan dalam penelitian bahan alam.
Peranan antioksidan sangat penting dalam meredam efek radikal bebas yang berkaitan erat dengan terjadinya penyakit degeneratif seperti tekanan darah tinggi, jantung koroner, diabetes dan kanker yang didasari oleh proses biokimiawi dalam tubuh. Radikal bebas yang dihasilkan secara terus menerus selama proses metabolisme normal, dianggap sebagai penyebab terjadinya kerusakan fungsi sel-sel tubuh yang akhirnya menjadi pemicu timbulnya penyakit degeneratif. Reaksi radikal bebas secara umum dapat dihambat oleh antioksidan tertentu baik alami maupun sintetis. Sebahagian besar antioksidan alami berasal dari tanaman, antara lain berupa senyawaan tokoferol, karatenoid, asam askorbat, fenol, dan flavonoid.
Senyawa bioaktif hampir selalu toksik pada dosis tinggi, oleh karena itu daya bunuh in vivo dari senyawa terhadap organisme hewan dapat digunakan untuk menapis ekstrak tumbuhan yang mempunyai bioaktivitas dan juga memonitor fraksi bioaktif selama fraksinasi dan pemurnian. Salah satu organisme yang sesuai untuk hewan uji adalah brine shrimp (udang laut).
 Untuk mengetahui toksisitas ekstrak daun  dalam penelitian ini digunakan  metode BSLT (Brine Shrimp Lethality Test) dan untuk mengetahui aktivitas ekstrak daun  sebagai antioksidan digunakan metode DPPH (-1,1-difenil-2-pikrilhidrazil). Pengukuran antioksidan secara ‘Efek peredaman radikal bebas DPPH’ merupakan metode pengukuran antioksidan yang sederhana, cepat dan tidak membutuhkan banyak reagen seperti halnya uji lain (xantin-xantin oksidase, metode Tiosianat, antioksidan total). Hasil pengukuran menunjukkan kemampuan antioksidan sampel secara umum tidak berdasar jenis radikal yang dihambat. Pada metode ini, DPPH berperan sebagai radikal bebas yang diredam oleh antioksidan dari bahan uji, dimana DPPH akan bereaksi dengan antioksidan tersebut membentuk 1,1,-difenil-2- pikril hidrazin. Reaksi ini menyebabkan terjadinya perubahan warna yang dapat diukur dengan spektrofotometer sinar tampak pada λ515 nm, sehingga aktivitas peredaman radikal bebas oleh sampel dapat ditentukan.

Uji Toksisitas dengan Metode BSLT. Metode Meyer et al.  digunakan untuk mempelajari toksisitas sampel secara umum dengan menggunakan telur udang (Artemia salina Leach).  Penetasan Larva Udang, disiapkan bejana untuk penetasan telur udang. Di satu ruang dalam bejana tersebut diletakkan lampu untuk menghangatkan suhu dalam penetasan, sedangkan di ruang sebelahnya diberi air laut. Kedalam air laut dimasukkan + 50-100 mg telur udang untuk ditetaskan. Pada bagian telur ditutup dengan aluminium foil, dan lampu dinyalakan selama 48 jam untuk menetaskan telur. Diambil larva udang yang akan diuji dengan pipet.

Prosedur Uji Toksisitas dengan Metode BSLT. Sebanyak 100 μL air laut yang mengandung larva udang sebanyak 10-12 ekor dipipet, kemudian dimasukkan ke dalam wadah uji. Di tambahkan larutan sampel yang akan diuji masing-masing sebanyak 100 μL, dengan konsentrasi 10, 100, 200, 500 dan 1000 ppm. Untuk setiap konsentrasi dilakukan 3 kali pengulangan (triplikat). Larutan diaduk sampai homogen. Untuk kontrol dilakukan tanpa penambahan sampel. Larutan dibiarkan selama 24 jam, kemudian dihitung jumlah larva yang mati dan masih hidup dari tiap lubang. Angka mati dihitung dengan menjumlahkan larva yang mati dalam setiap konsentrasi (3 lubang). Angka hidup dihitung dengan menjumlahkan larva yang hidup dalam setiap konsentrasi (3 lubang).Perhitungan akumulasi mati tiap konsentrasi dilakukan dengan cara berikut: akumulasi mati untuk konsentrasi 10 ppm = angka mati pada konsentrasi tersebut, akumulasi mati untuk konsentrasi 100 ppm = angka mati pada konsentrasi 10 ppm + angka mati pada konsentrasi 100n ppm, akumulasi mati untuk konsentrasi 200 ppm = angka mati pada konsentrasi 10 ppm + angka mati pada konsentrasi 100 ppm + angka mati pada konsentrasi 200 ppm. Akumulasi angka mati dihitung sampai konsentrasi 1000 ppm. Perhitungan akumulasi hidup tiap konsentrasi dilakukan dengan cara berikut: akumulasi hidup untuk konsentrasi 1000 ppm = angka hidup pada konsentrasi 1000 ppm, akumulasi hidup untuk konsentrasi 500 ppm = angka hidup pada konsentrasi 1000 ppm + angka hidup pada konsentrasi 500 ppm, akumulasi hidup untuk konsentrasi 200 ppm = angka hidup pada konsentrasi 1000 ppm + angka hidup pada konsentrasi 500 ppm + angka hidup pada konsentrasi 200 ppm. Akumulasi angka hidup dihitung sampai konsentrasi 10 ppm.
Selanjutnya dihitung mortalitas dengan cara: akumulasi mati dibagi jumlah akumulasi hidup dan mati (total) dikali 100%. Grafik dibuat dengan log konsentrasi sebagai sumbu x terhadap mortalitas sebagai sumbu y. Nilai LC50 merupakan konsentrasi dimana zat menyebabkan kematian 50% yang diperoleh dengan memakai persamaan regresi linier y = a + bx. Suatu zat dikatakan aktif atau toksik bila nilai LC50 < 1000 ppm untuk ektrak dan < 30 ppm untuk suatu senyawa.

III.           Alat dan Bahan
  • Kotak penetasan larva
  • Mikro pipet  2-20 µL
  • Mikro pipet 20-200 µL
  • Wellplate
  • Kaca pembesar
  • Tabung reaksi
  • Labu ukur
  • kotak
  • steroform

IV.           Prosedur kerja
a.Penetasan larva

b.Orientasi konsentrasi
V.             HASIL PENGAMATAN
Analisis data BSCT dengan analisis Probit
Kelas
Konsentrasi ppm
Log C (y)
Hidup
mati
% kematian
Probit
Lc 50
A
Ekstrak BINTARO
10000
4
-
10
100
8,7190
-
1000
3
-
10
100
8,7190
100
2
-
10
100
8,7190
10
1
-
10
100
8,7190
1
0
-
10
100
8,7190
0,1
-1
-
10
100
8,7190
B
Ekstrak Alpukat
10000
4
-
10
100
8,7190
26,4338 ppm
1000
3
1
9
90
6,2816
100
2
4
6
60
5,2533
10
1
5
5
50
5,000
1
0
2
8
80
5,8416
0,1
-1
3
7
70
5,5244

Ket :
Digunakan regresi linier
Y = a + bx
Probit  = a + b (log C)
a = 3,26715
b = 1,21853
r = 0,9271
di hitung LC 50 ?
LC 50 = (5-a)/b
LC 50 = (5-3,26715)/1,21853
LC  50 = 1,42216
Antilog LC 50 = 26,4338 ppm





Analisis data BSCT dengan analisis Reed-Munch
kelas
Konsentrasi ppm
hidup
mati
∑mati
∑ hidup
total
ratio
% kematian
LC 50
B
Ekstrak Alpukat
0,1
11
19
19
45
64
19/64
29,68
0,6223 ppm
1
7
23
42
34
76
42/76
55,26
10
13
17
59
27
86
52/79
68,6
100
13
17
76
14
90
76/90
84,4
1000
1
29
105
1
106
105/106
99,0
10000
0
30
135
0
135
135/135
100

Di hitung :
h= 50%-a/(b-a)
h : ukuran jarak
a : % yang menyebabkan kematian lebih kecil  dari 50 %
b : % yang menyebabkan kematian  lebih besar dari 50 %

h = (50%-29,68%)/(55,26%-29,68%)

Di hitung :
i = log kematian diatas 50% / kematian dibawah 50%                                               
i : log kenaikan dosis
i = log 1/0,1
i = log 10
i = 1

Di hitung :
g = h X i
g : hasil kali dari ukuran jarak dan log kenaikan dosis
g = 0,749 X 1
g = 0,749
DI hitung :
y = g + log kematian lebih kecil dari 50 %
y : hasil penjumlahan g dan log kematian kecil dari 50 %
y = 0,749 + log 0,1
y = 0,749 – 1
y = - 0,206

LC  50 = anti log y
LC  50 = anti log – 0,206
LC  50 = 0,6223 ppm

Analisis data BSCT dengan analisis Farmakope
kelas
Konsentrasi ppm
Log dosis
Hidup
Mati
∑ mati
Pi
∑ Pi
LC 50
B
Ekstrak Alpukat
0,1
-1
11
19
63
0,63
4,47
1,071 ppm
1
0
7
23
76
0,76
10
1
13
17
56
0,56
100
2
13
17
56
0,56
1000
3
1
29
96
0,96
10000
4
0
30
100
100

Di hitung :
m = a – b ( Pi – 0,5)
Pi  :  % kematian terhadap % seluruh hewan yang dicobakan.
m = 4 – 1 (4,47 – 0,5)
m = 4 – 1 (3,97)
m = 4 – 3,97
m = 0,03

LC 50 = anti log m
LC 50 = anti log 0,03
LC 50 = 1,071 ppm

VI.           Pembahasan
Uji BSLT (Brine Shrimp Lethality Test) merupakan uji toksisitas yang digunakan sebagai uji permulaan untuk mengetahui aktivitas dari suatu zat atau senyawa yang terkandung dalam suatu ekstrak atau suatu isolat murni.
Pada praktikum kali ini larva udang yang digunakan adalah jenis Artemia salina yang telah berumur 48 jam dan proses pembenihan telur udang yang digunakan adalah sebanyak 0,5 gram dan dimasukkan dalam air garam dengan kadar 38%  (38 gram dalam 1liter air) hal ini dilakukan sebagai simulasi dari habitat asli udang yaitu air laut.
Adapun ekstrak yang digunakan adalah ekstrak buah alpukat dan bintaro yang dibuat larutan dengan konsentrasi yang berbeda-beda yaitu mulai dari 10000, 1000, 100, 10, 1 dan 0,1 ppm. Hal ini bertujuan untuk mengetahui LC50 dari masing - masing ekstrak tersebut dengan berbagai konsentrasi.
Pada prakteknya dengan perlakuan yang sama yaitu larutan ekstrak yang dimasukkan dalam tabung reaksi yang berisi 10 buah larva dengan 10 ml larutan (9 ml air garam dan ekstrak sebanyak 1 ml). Ekstrak bintaro menunjukkan hasil data yang error, hal ini ditunjukkan dengan adanya kematian pada semua larva udang di berbagai konsentrasi. Adapun untuk ekstrak alpukat menunjukkan hasil bahwa dengan naiknya konsentrasi maka larva udang yang mati semakin banyak, tetapi pada konsentrasi 1 dan 0,1 ppm tidak menunjukkan hal denmikian, sehingga data yang dipakai adalah pada konsentrasi 10000 sampai 100 ppm. Selain itu percobaan dilakukan  triplo agar didapat data statistik yang  baik sehingga, dapat dihitung secara statistik dari data tersebut.
Dalam penentuan  nilai LC50 ini dapat dilakukan dengan 3 cara/metode, yaitu :
1.        Perhitungan probit
2.        analisis Reed-Munch
3.        analisis Farmakope
Dalam perhitungan dengan metode analisis probit, diperlukan tabel probit dan rumus regresi liniear untuk menentukan nilai a, b dan r. Kemudian dimasukkan dalam rumus X50 = (b-a)/b dan kemudian dapat ditentukan nilai LC50. Adapun hasil perhitungan dengan menggunakan metode ini menunjukkan hasil bahwa LC50 adalah 26,438 ppm.
Sedangkan dalam perhitungan dengan metode analisis Reed-Munch sebelumnya harus diketahui jumlah larva yang mati dan hidup. Yang kemudian dihitung ukuran jarak (h) = (50%-a)/(b-a)    , kenaikan dosis (i) = log kematian diatas 50 %/kematian dibawah 50% , nilai (g) = h X I , nilai (y) = g + log kematian lebih kecil dari 50 %, kemudian dapat ditentukan bahwa:
nilai LC 50 = anti log y
Dengan menggunakan metode analisis Reed-Munch didapatkan hasil LC50 sebesar 22,54 ppm.
Perhitungan data BSLT dengan metode yang ketiga yaitu dengan analisis Farmakope. Terlebih dahulu dicari nilai Pi dan sigma Pi untuk selanjutnya dimasukkan dalam rumus :
m = a – b ( ∑ Pi – 0,5)      ∑Pi = % kematian terhadap % seluruh hewan yang dicobakan
a = dosis terendah yang dapat menyebabkan kematian  100%
b = beda log dosis yang berurutan
selanjutnya dapat ditentukan nilai LC 50 = anti log m. Dari hasil perhitungan didapatkan nilai LC50 sebesar 26,3 ppm.
Dari ketiga metode tersebut dapat diketahui bahwa didapatkan LC50 dengan perbedaan yang tak terlalu jauh yaitu 26,438 ppm, 22,54 ppm, dan 22,54 ppm sehingga hal ini menunjukkan bahwa ekstrak biji alpukat bersifat toksik terhadap larva udang karena LC 50 ≥ 1000 µg/mL, sedangkan suatu ekstrak dikatakan aktif apabila mempunyai LC 50 ≤ 1000 µg/mL.


VII.         Kesimpulan

Berdasarkan hasil percobaan yang telah dilakukan :
1.       Semakin tinggi konsentrasi ekstrak semakin banyak larva udang yang mati.
2.       Nilai LC50 pada metode perhitungan analisis probit adalah 26,438 ppm,
pada analisis Reed-Munch nilai LC50 adalah 26,438 ppm,
dan pada analisis farmakope nilai LC50 adalah 26,3 ppm.
3.     Ekstrak biji bintaro tidak dapat dihitung LC50 nya karena pada berbagai konsentrasi larva udang mati semua.


VIII.       Daftar Pustaka
Anonim. 2000. Informatorium Obat Nasional Indonesia. Depkes RI : Jakarta
Anief, Moh.  2000.  Ilmu Meracik Obat. Gadjah Mada University Press : Yogyakarta
Anonim. 1995. Farmakope Indonesia Edisi IV. Depkes RI : Jakarta
Ansel, Howard.C. 1989. Pengantar Bentuk Sediaan Farmasi. Universitas Indonesia Press : Jakarta
Ernst Mutschler, 1986, Dinamika Obat ; Farmakologi dan Toksikologi (terjemahan), ITB, Bandung