Yunietha Lakhiafa

Pembuatan Kurva kalibrasi

I.                    Tujuan
Mampu memahami tahap-tahap dalam pembuatan kurva kalibrasi.
II.                  Landasan Teori
Pengukuran analitik memiliki peranan yang sangat penting dalam bidang kimia, khususnya dalam farmasi. Tujuan dari pengukuran analitik ini adalah untuk menentukan nilai sebenarnya dari suatu parameter kuantitas kimia, contohnya seperti: konsentrasi, pH, dan lain-lain. Pengukuran analitik ini dapat menggunakan metode konvensional maupun modern, baik secara kualitatif maupun kuantitatif
Nilai sebenarnya adalah nilai yang mengkarakterisasi suatu kuantitas secara benar dan didefinisikan pada kondisi tertentu yang eksis pada saat kuantitas tersebut diukur, beberapa contoh parameter yang dapat ditentukan secara analitik adalah konsentrasi, pH, temperatur, titik didih, kecepatan reaksi, dan lain lain
Dalam pengamatan eksperimen secara umum, hasil yang diperoleh pasti tidak dapat terlepas dari faktor kesalahan. Nilai parameter sebenarnya yang akan ditentukan dari suatu perhitungan analitik tersebut adalah ukuran ideal. Nilai tersebut hanya dapat diperoleh jika semua penyebab kesalahan pengukuran dihilangkan dan jumlah populasi tidak terbatas. Faktor penyebab kesalahan ini dapat disebabkan oleh berbagai hal, antara lain adalah faktor bahan kimia, peralatan, analis, kondisi pengukuran, dan lain-lain. Salah satu cara yang dapat digunakan untuk mengurangi kesalahan dalam pengukuran analitik ini adalah dengan proses kalibrasi.

Validasi, Verifikasi, dan Kalibrasi
Validasi metode analisis bertujuan untuk memastikan dan mengkonfirmasi bahwa metode analisis tersebut sudah sesuai untuk peruntukannya. Validasi biasanya diperuntukkan untuk metode analisa yang baru dibuat dan dikembangkan. Sedangkan untuk metode yang memang telah tersedia dan baku (misal AOAC, ASTM, dan lainnya), dimana metode tersebut baru pertama kali akan digunakan pada laboratorium tertentu, biasanya tidak perlu dilakukan validasi, namun hanya verifikasi. Tahapan verifikasi mirip dengan validasi, hanya saja parameter yang dilakukan tidak selengkap validasi. Parameter analisis yang harus dipertimbangkan dalam metode validasi adalah :

1.       Akurasi (kecermatan)
2.       Presisi (keseksamaan, ketelitian)
3.       Selektivitas
4.       Linearitas dan rentang
5.       Batas deteksi dan batas kuantitasi
6.       Ketangguhan metode (ruggedness)
7.       Kekuatan (robustness)
Sedangkan pengertian kalibrasi menurut ISO/IEC Guide 17025:2005 dan Vocabulary of International Metrology (VIM) adalah serangakaian kegiatan yang membentuk hukuman antara nilai yang ditunjukkan oleh instrumen ukur atau sistem pengukuran atau nilai yang diwakili oleh bahan-bahan ukur dengan nilai-nilai yang sudah diketahui yang berkaitan dengan besaran yang diukur dalam kondisi tertentu.
Dengan kata lain, kalibrasi adalah kegiatan untuk menentukan kebenaran konvensional nilai penunjukkan alat ukur dan bahan ukur dengan cara membandingkan terhadap standar ukur yang mampu telusur (traceable) ke standar nasional untuk satuan ukuran dan/atau internasional.
Sementara interval kalibrasi adalah :
  1. Kalibrasi harus dilakukan secara periodik.
  2. Selang waktu kalibrasi dipengaruhi oleh jenis alat ukur, frekuensi pemakaian, dan pemeliharaaan.
ü  Bisa dinyatakan dalam beberapa cara :
  • Dengan waktu kalender
  • Dengan waktu pemakaian
Kombinasi cara pertama dan kedua, tergantung mana yang lebih dulu tercapai.

Spektrofotometer UV-Visible
Dalam analisis spektrofotometri digunakan suatu sumber radiasi yang menjorok ke dalam daerah ultraviolet spektrum itu. Dari spektrum ini, dipilih panjang-panjang gelombang tertentu dengan lebar pita kurang dari 1 nm. Proses ini memerlukan penggunaan instrumen yang lebih rumit dan karenanya lebih mahal. Instrumen yang digunakan untuk maksud ini adalah spektrofotometer, dan seperti tersirat dalam nama ini, instrumen ini sebenarnya terdiri dari dua instrumen dalam satu kotak sebuah spektrometer dan sebuah fotometer.
Spektrofotometer adalah alat untuk mengukur transmitans atau absorbans suatu contoh sebagai fungsi panjang gelombang; pengukuran terhadap suatu deretan contoh pada suatu panjang gelombang tunggal mungkin juga dapat dilakukan. Alat-alat demikian dapat dikelompokkan naik sebagai manual atau perekam, maupun sebagai sinar-tunggal atau sinar-rangkap. Dalam praktek, alat-alat sinar tunggal biasanya dijalankan dengan tangan dan alat-alat sinar-rangkap biasanya menonjolkan pencatatan spektrum absorbsi, tetapi adalah mungkin untuk mencatat satu spektrum dengan suatu alat sinar tunggal. Unsur-unsur terpenting suatu spektrofotometer adalah sebagai berikut:
1.       Sumber energi radiasi yang kontinyu dan meliputi daerah spektrum
2.       Monokromator, yang merupakan suatu alat untuk mengisolasi suatu berkas sempit dari panjang gelombang-panjang gelombang dari spektrum luas yang disiarkan oleh sumber (tentu saja tepat monokromatisitas tidak dicapai).
3.       Wadah untuk contoh
4.       Detektor yang merupakan suatu transducer yang mengubahenergi radiasi menjadi isyarat listrik.
5.       Penguat dan  rangkaian yang bersangkutan yang membuat isyarat listrik cocok untuk diamati.
6.       Sistem pembacaan yang dapat mempertunjukkan besarnya isyarat listrik.

Spektrofotometer UV-Visible, alat ini banyak bermanfaat untuk penentuan konsentrasi senyawa-senyawa yang dapat menyerap radiasi pada daerah ultraviolet (200 – 400 nm) atau daerah sinar tampak (400 – 800 nm) (Sastrohamidjojo, 1991). Analisis ini dapat digunakan yakni dengan penentuan absorbansi dari larutan sampel yang diukur.
Prinsip penentuan spektrofotometer UV-Vis adalah aplikasi dari Hukum Lambert-Beer, yaitu:
                Jika sinar monokromatic dilewatkan suatu larutan maka penurunan insensitas sinar berbanding langsung dengan insensitas radiasi ( I ), konsentrasi spesies (c),  dan dengan ketebalan lapisan larutan (b).

A = - log T = - log It / Io = ε . b . C
Dimana : A = Absorbansi dari sampel yang akan diukur
T = Transmitansi
I0 = Intensitas sinar masuk
It = Intensitas sinar yang diteruskan
ε = Koefisien ekstingsi
b = Tebal kuvet yang digunakan
C = Konsentrasi dari sampel

Penyerapan sinar UV & Visibel oleh Molekul. Penyerapan (absorbsi) sinar UV dan Visibel pada umumnya dihasilkan oleh eksitasi elektron-elektron ikatan. Yaitu:
          Penyerapan oleh transisi elektron ikatan dan elektron anti ikatan
          Penyerapan oleh transsi elektron d dan f dari molekul kompleks
          Penyerapan oleh perpindahan muatan
Panjang gelombang cahaya UV atau cahaya tampak bergantung pada mudahnya promosi elektron. Molekul-molekul yang memerlukan lebih banyak energi untuk promosi elektron, akan menyerap pada panjang gelombang yang lebih pendek. Molekul yang memerlukan energi yang lebih sedikit akan menyerap cahaya dalam daerah tampak (yakni senyawa berwarna) mempunyai elektron yang lebih mudah dipromosikan daripada senyawa yang menyerap pada panjang gelombang UV yang lebih pendek.
Suatu spektrofotometer standar terdiri atas spektrofotometer untuk menghasilkan cahaya dengan panjang gelombang terseleksi yaitu bersifat monokromatik serta suatu fotometer yaitu suatu piranti untuk mengukur intensitas berkas monokromatik, digabungkan bersama dinamakan sebagai spektrofotometer.
Spektrofotometer dapat berupa sinar tunggal atau sinar ganda. Dalam berkas satu instrumen (seperti Spectronic 20), semua cahaya melewati sel sampel. I o harus diukur dengan membuang sampel. Ini adalah desain awal, tetapi masih umum digunakan baik dalam pengajaran dan laboratorium industri.
Dalam berkas ganda instrumen, cahaya dibagi menjadi dua berkas sebelum mencapai sampel. Satu berkas digunakan sebagai acuan, yang lain melewati sinar sampel. Beberapa instrumen double-beam memiliki dua detektor (photodiodes), dan sampel dan berkas referensi diukur pada waktu yang sama. Dalam instrumen lain, kedua balok melewati sebuah balok helikopter, yang menghambat satu berkas pada suatu waktu. Detektor-ubah antara mengukur sampel balok dan balok referensi.

Pembatasan dalam Hukum Lambert-Beer :
  • Sinar yang digunakan dianggap monokromatis
  • Peyerapan terjadi daam volume yang memiliki penampang luas yang sama
  • Tidak ada senyawa lain yang menyerap dalam larutan senyawa
  • Tidak terjadi fluoresensi atau fosforesensi
  • Indeks bias tidak tergantung pada konsentrasi larutan
Hal-hal penting dalam pengukuran spektrofotometri UV-Visibel :
  • Terutama untuk  senyawa yang semula tidak berwarna dan akan diukur dengan spektrofotometer Visibel dilakukan derivatisasi.
  • Waktu operasional (operating time) untuk mengetahui waktu pengukuran yang stabil.
  • Pemilihan panjang gelombang maksimum (λ max)
  • Pembuatan kurva baku sebaiknya sering diperiksa ulang.
  • Pembacaan absorbansi sampel/cuplikan sebaiknya dalam rentang 0,2 – 0,8.
III.                Alat dan Bahan
v  Alat :
1.       Beker glass
2.       Spektrofotometer
3.       Kertas grafik
4.       Labu ukur 100 ml
5.       Pipet volumetrik
v  Bahan :
1.       Aquadest
2.       Parasetamol
3.       NaOH

IV.               Prosedur Kerja
v  Membuat larutan baku (NaOH)
1.       Menimbang NaOH 4 gram dilarutkan dalam 1000 ml aquadest, maka didapat larutan NaOH 0,1 N

v  Membuat larutan parasetamol
1.       Menimbang 100 mg parasetamol dan dilarutkan dalam 100 ml NaOH, maka didapat larutan dengan konsentrasi 1000 ppm
2.       Membuat larutan dengan konsentrasi 100 ppm dengan melarutkan 10 ml larutan induk dalam 100 ml NaOH
3.      Membuat larutan dengan konsentrasi 4 ppm dengan melarutkan 0,4 ml (larutan dengan konsentrasi 100 ppm) dalam 100 ml NaOH
4.       Membuat larutan dengan konsentrasi 6 ppm dengan melarutkan 0,6 ml (larutan dengan konsentrasi 100 ppm) dalam 100 ml NaOH
5.       Membuat larutan dengan konsentrasi 8 ppm dengan melarutkan 0,8 ml (larutan dengan konsentrasi 100 ppm) dalam 100 ml NaOH
6.       Membuat larutan dengan konsentrasi 10 ppm dengan melarutkan 1 ml (larutan dengan konsentrasi 100 ppm) dalam 100 ml NaOH
7.       Membuat larutan dengan konsentrasi 12 ppm dengan melarutkan 1,2 ml (larutan dengan konsentrasi 100 ppm) dalam 100 ml NaOH

VI.               Pembahasan
Pada percobaan kali ini dilakukan pembuatan kalibrasi dari larutan uji parasetamol, yang  diawali dengan pembuatan larutan NaOH 0,1N. Larutan ini digunakan sebagai pelarut parasetamol karena parasetamol sukar larut dalam air.
Adapun tujuan kalibrasi adalah untuk mencapai ketertelusuran pengukuran. Hasil pengukuran dapat dikaitkan atau ditelusur sampai ke standar yang lebih teliti atau tinggi (standar primer nasional atau internasional) melalui rangkaian perbandingan yang tidak terputus, dalam artian standar ukur itu akan lebih baik apabila berupa standar yang rantainya mendekati SI sehingga tingkat ketidakpastian (error) makin kecil.
Manfaat kalibrasi adalah sebagai berikut :
b.      Untuk mendukung sistem mutu yang diterapkan diberbagai industri pada peralatan laboratorium dan produksi yang dimiliki.
c.       Mengetahui seberapa jauh perbedaan (penyimpangan) antara harga yang benar dengan harga yang ditunjukkan oleh alat ukur.
Prinsip-prinsip dasar kalibrasi adalah sebagai berikut :
·         Obyek ukur (Unit Under Test)
·         Standar ukur, alat standar kalibrasi, prosedur atau metode standar yang mengacu pada standar kalibrasi internasional atau prosedur yang dikembangkan sendiri oleh laboratorium yang sudah terujui (diversifikasi).
·         Operator atau teknisi, dipersyaratkan mempunyai kemampuan teknik kalibrasi (bersertifikat).
·         Lingkungan yang dikondisikan, suhu dan kelembaban selalu dikontrol, gangguan dari faktor lingkungan luar selau diminimalkan (sumber ketidakpastian pengukuran).

Mulanya dibuat larutan induk parasetamol 1000 ppm yang kemudian larutan ini di encerkan hingga 10 ppm dengan menggunakan pelarut NaOH. Tujuan dari pengenceran ini adalah untuk mengetahui absorbansi dari larutan parasetamol yang akan di uji. Setelah dilakukan uji spekrofotometer didapat absorbansi dari larutan parasetamol 0,6 untuk 10 ppm. Dari absorbansi ini dapat diperoleh absorptivitas molar 0,06 . Tujuan pengujian larutan parasetamol di awal ini merupakan suatu simulasi yang mana dimaksudkan untuk mengetahui berapa konsentrasi parasetamol yang akan di uji. Berdasarkan literatur absorbansi terbaik suatu larutan berkisar rentang nilai 0,2 hingga 0,8.
Sehingga dengan menggunakan persamaan A = ε . b . c  didapat konsentrasi terbaik berkisar 3,33 ppm hingga 13,33 ppm.
Dari nilai konsentrasi yang diperoleh baru dapat dilakukan pembuatan kurva kalibrasi. Larutan parasetamol yang di uji dibuat dalam konsentrasi 4 ppm, 6 ppm, 8 ppm, 10 ppm, 12 ppm. Nilai regresi yang diperoleh adalah 0,9955. Sedangkan nilai regresi yang baik adalah mendekati 1 karena kesalahan inilah yang menyebabkan garis kurva kalibrasi tidak linear ( garis lurus ). Namun hasil ini tidak terlalu jauh dari literatur yang ada, sehingga masih dapat digunakan sebagai acuan.
 Berdasarkan hasil percobaan yang telah dilakukan, didapat panjang gelombang dari larutan parasetamol adalah 256,5 nm. Sedangkan panjang gelombang larutan parasetamol berdasarkan literatur adalah 257 nm. Kesulitan-kesulitan saat melakukan percobaan pun kerap kali terjadi sehingga untuk memperoleh hasil yang baik, percobaan dilakukan berulang-ulang.
Penyimpangan-penyimpangan tersebut mungkin disebabkan oleh:
·         Masih adanya zat pengotor dari larutan tersebut.
Pengotor seperti pencucian alat yang tidak bersih dimungkinkan membawa dampak terhadap hasil yang diperoleh dari percobaan ini.
·         Kekurangtelitian dari praktikan.
Kurangnya Ketelitian praktikan dapat memungkinkan perbedaan panjang gelombang yang diperoleh seperti kurang telitinya dalam penimbangan bahan, pengambilan pelarut, maupun ketidak homogenan dalam pengocokan.

VII.             Kesimpulan
Berdasarkan hasil percobaan yang telah dilakukan diperoleh       :
1.         Nilai panjang gelombang dari larutan uji parasetamol adalah 256,5 nm.
2.         Nilai regresi dari kurva kalibrasi larutan parasetamol adalah 0,9955.
3.         Adanya perbedaan yang diperoleh dengan literatur yang ada kemungkinan disebabkan adanya zat pengotor dari larutan uji.
4.         Untuk absorbansi terbaik ( 0,2 hingga 0,8 ) larutan parasetamol berada pada konsentrasi 3,33 – 13,33 ppm.
5.         Pada uji konsentrasi larutan parasetamol 4 ppm, 6 ppm, 8 ppm, 10 ppm dan 12 ppm diperoleh nilai absorbansi yang baik yaitu 0,212 hingga 0,799.  


VIII.           Daftar Pustaka
Departemen Kesehatan republic Indonesia. 1979. Farmakope Indonesia, edisi III . Jakarta : Badan Pengawas Obat dan Makanan.
Mansoor m. Amiji, beverly j. Sandmann. 1993. Applied Physical Pharmacy. Bosto: mc Graw Hill.
Martin, Alfred dkk. 1990. Farmasi Fisik. Jakarta: UI Press.