Pembuatan Kurva
kalibrasi
I.
Tujuan
Mampu memahami tahap-tahap dalam pembuatan kurva
kalibrasi.
II.
Landasan Teori
Pengukuran analitik memiliki peranan yang sangat
penting dalam bidang kimia, khususnya dalam farmasi. Tujuan dari pengukuran
analitik ini adalah untuk menentukan nilai sebenarnya dari suatu parameter
kuantitas kimia, contohnya seperti: konsentrasi, pH, dan lain-lain. Pengukuran
analitik ini dapat menggunakan metode konvensional maupun modern, baik secara
kualitatif maupun kuantitatif
Nilai sebenarnya adalah nilai yang mengkarakterisasi
suatu kuantitas secara benar dan didefinisikan pada kondisi tertentu yang eksis
pada saat kuantitas tersebut diukur, beberapa contoh parameter yang dapat
ditentukan secara analitik adalah konsentrasi, pH, temperatur, titik didih,
kecepatan reaksi, dan lain lain
Dalam pengamatan eksperimen secara umum, hasil yang
diperoleh pasti tidak dapat terlepas dari faktor kesalahan. Nilai parameter
sebenarnya yang akan ditentukan dari suatu perhitungan analitik tersebut adalah
ukuran ideal. Nilai tersebut hanya dapat diperoleh jika semua penyebab
kesalahan pengukuran dihilangkan dan jumlah populasi tidak terbatas. Faktor
penyebab kesalahan ini dapat disebabkan oleh berbagai hal, antara lain adalah
faktor bahan kimia, peralatan, analis, kondisi pengukuran, dan lain-lain. Salah
satu cara yang dapat digunakan untuk mengurangi kesalahan dalam pengukuran
analitik ini adalah dengan proses kalibrasi.
Validasi,
Verifikasi, dan Kalibrasi
Validasi metode analisis bertujuan untuk memastikan dan
mengkonfirmasi bahwa metode analisis tersebut sudah sesuai untuk peruntukannya.
Validasi biasanya diperuntukkan untuk metode analisa yang baru dibuat dan
dikembangkan. Sedangkan untuk metode yang memang telah tersedia dan baku (misal
AOAC, ASTM, dan lainnya), dimana metode tersebut baru pertama kali akan
digunakan pada laboratorium tertentu, biasanya tidak perlu dilakukan validasi,
namun hanya verifikasi. Tahapan verifikasi mirip dengan validasi, hanya saja
parameter yang dilakukan tidak selengkap validasi. Parameter analisis yang
harus dipertimbangkan dalam metode validasi adalah :
1. Akurasi (kecermatan)
2. Presisi (keseksamaan, ketelitian)
3. Selektivitas
4. Linearitas dan rentang
5. Batas deteksi dan batas kuantitasi
6. Ketangguhan metode (ruggedness)
7. Kekuatan (robustness)
Sedangkan pengertian kalibrasi menurut ISO/IEC Guide
17025:2005 dan Vocabulary of International Metrology (VIM) adalah serangakaian
kegiatan yang membentuk hukuman antara nilai yang ditunjukkan oleh instrumen
ukur atau sistem pengukuran atau nilai yang diwakili oleh bahan-bahan ukur
dengan nilai-nilai yang sudah diketahui yang berkaitan dengan besaran yang
diukur dalam kondisi tertentu.
Dengan kata lain, kalibrasi
adalah kegiatan untuk menentukan kebenaran konvensional nilai penunjukkan alat
ukur dan bahan ukur dengan cara membandingkan terhadap standar ukur yang mampu
telusur (traceable) ke standar nasional untuk satuan ukuran dan/atau
internasional.
Sementara interval kalibrasi adalah :
- Kalibrasi harus dilakukan secara periodik.
- Selang waktu kalibrasi dipengaruhi oleh jenis alat ukur, frekuensi pemakaian, dan pemeliharaaan.
ü
Bisa dinyatakan dalam beberapa cara :
- Dengan waktu kalender
- Dengan waktu pemakaian
Kombinasi cara pertama dan kedua, tergantung mana yang lebih
dulu tercapai.
Spektrofotometer UV-Visible
Dalam analisis spektrofotometri digunakan suatu sumber
radiasi yang menjorok ke dalam daerah ultraviolet spektrum itu. Dari spektrum
ini, dipilih panjang-panjang gelombang tertentu dengan lebar pita kurang dari 1
nm. Proses ini memerlukan penggunaan instrumen yang lebih rumit dan karenanya
lebih mahal. Instrumen yang digunakan untuk maksud ini adalah spektrofotometer,
dan seperti tersirat dalam nama ini, instrumen ini sebenarnya terdiri dari dua
instrumen dalam satu kotak sebuah spektrometer dan sebuah fotometer.
Spektrofotometer adalah alat untuk mengukur transmitans atau absorbans
suatu contoh sebagai fungsi panjang gelombang; pengukuran terhadap suatu
deretan contoh pada suatu panjang gelombang tunggal mungkin juga dapat
dilakukan. Alat-alat demikian dapat dikelompokkan naik sebagai manual atau
perekam, maupun sebagai sinar-tunggal atau sinar-rangkap. Dalam praktek,
alat-alat sinar tunggal biasanya dijalankan dengan tangan dan alat-alat
sinar-rangkap biasanya menonjolkan pencatatan spektrum absorbsi, tetapi adalah
mungkin untuk mencatat satu spektrum dengan suatu alat sinar tunggal.
Unsur-unsur terpenting suatu spektrofotometer adalah sebagai berikut:
1.
Sumber
energi radiasi yang kontinyu dan meliputi daerah spektrum
2.
Monokromator,
yang merupakan suatu alat untuk mengisolasi suatu berkas sempit dari panjang
gelombang-panjang gelombang dari spektrum luas yang disiarkan oleh sumber (tentu saja
tepat monokromatisitas tidak dicapai).
3.
Wadah
untuk contoh
4.
Detektor
yang merupakan suatu transducer yang mengubahenergi radiasi menjadi isyarat listrik.
5.
Penguat
dan rangkaian yang bersangkutan yang
membuat isyarat listrik cocok untuk diamati.
6.
Sistem
pembacaan yang dapat mempertunjukkan besarnya isyarat listrik.
Spektrofotometer UV-Visible, alat ini
banyak bermanfaat untuk penentuan konsentrasi senyawa-senyawa yang dapat
menyerap radiasi pada daerah ultraviolet (200 – 400 nm) atau daerah sinar
tampak (400 – 800 nm) (Sastrohamidjojo, 1991). Analisis ini dapat
digunakan yakni dengan penentuan absorbansi
dari larutan sampel yang diukur.
Prinsip penentuan
spektrofotometer UV-Vis adalah aplikasi dari Hukum Lambert-Beer, yaitu:
Jika
sinar monokromatic dilewatkan suatu larutan maka penurunan insensitas sinar
berbanding langsung dengan insensitas radiasi ( I ), konsentrasi spesies
(c), dan dengan ketebalan lapisan
larutan (b).
A = - log T = - log It / Io = ε . b . C
Dimana : A = Absorbansi
dari sampel yang akan diukur
T = Transmitansi
I0 = Intensitas sinar
masuk
It = Intensitas sinar yang
diteruskan
ε = Koefisien ekstingsi
b = Tebal kuvet yang
digunakan
C = Konsentrasi dari
sampel
Penyerapan
sinar UV & Visibel oleh Molekul. Penyerapan (absorbsi) sinar UV dan Visibel
pada umumnya dihasilkan oleh eksitasi elektron-elektron ikatan. Yaitu:
•
Penyerapan oleh transisi elektron ikatan dan
elektron anti ikatan
•
Penyerapan oleh transsi elektron d dan f dari
molekul kompleks
•
Penyerapan oleh perpindahan muatan
Panjang gelombang cahaya UV atau cahaya tampak bergantung
pada mudahnya promosi elektron. Molekul-molekul yang memerlukan lebih banyak
energi untuk promosi elektron, akan menyerap pada panjang gelombang yang lebih
pendek. Molekul yang memerlukan energi yang lebih sedikit akan menyerap cahaya
dalam daerah tampak (yakni senyawa berwarna) mempunyai elektron yang lebih
mudah dipromosikan daripada senyawa yang menyerap pada panjang gelombang UV
yang lebih pendek.
Suatu spektrofotometer standar terdiri atas
spektrofotometer untuk menghasilkan cahaya dengan panjang gelombang terseleksi
yaitu bersifat monokromatik serta suatu fotometer yaitu suatu piranti untuk
mengukur intensitas berkas monokromatik, digabungkan bersama dinamakan sebagai
spektrofotometer.
Spektrofotometer dapat berupa sinar tunggal atau sinar
ganda. Dalam berkas satu instrumen (seperti Spectronic 20), semua cahaya melewati
sel sampel. I o harus diukur dengan membuang sampel. Ini adalah desain awal,
tetapi masih umum digunakan baik dalam pengajaran dan laboratorium industri.
Dalam berkas ganda instrumen, cahaya dibagi menjadi dua
berkas sebelum mencapai sampel. Satu berkas digunakan sebagai acuan, yang lain
melewati sinar sampel. Beberapa instrumen double-beam memiliki dua detektor
(photodiodes), dan sampel dan berkas referensi diukur pada waktu yang sama.
Dalam instrumen lain, kedua balok melewati sebuah balok helikopter, yang
menghambat satu berkas pada suatu waktu. Detektor-ubah antara mengukur sampel
balok dan balok referensi.
Pembatasan dalam
Hukum Lambert-Beer :
- Sinar yang digunakan dianggap monokromatis
- Peyerapan terjadi daam volume yang memiliki penampang luas yang sama
- Tidak ada senyawa lain yang menyerap dalam larutan senyawa
- Tidak terjadi fluoresensi atau fosforesensi
- Indeks bias tidak tergantung pada konsentrasi larutan
Hal-hal penting
dalam pengukuran spektrofotometri UV-Visibel :
- Terutama untuk senyawa yang semula tidak berwarna dan akan diukur dengan spektrofotometer Visibel dilakukan derivatisasi.
- Waktu operasional (operating time) untuk mengetahui waktu pengukuran yang stabil.
- Pemilihan panjang gelombang maksimum (λ max)
- Pembuatan kurva baku sebaiknya sering diperiksa ulang.
- Pembacaan absorbansi sampel/cuplikan sebaiknya dalam rentang 0,2 – 0,8.
III.
Alat dan Bahan
v
Alat :
1. Beker
glass
2. Spektrofotometer
3. Kertas
grafik
4. Labu
ukur 100 ml
5. Pipet
volumetrik
v
Bahan :
1. Aquadest
2. Parasetamol
3. NaOH
IV.
Prosedur Kerja
v
Membuat larutan baku (NaOH)
1. Menimbang
NaOH 4 gram dilarutkan dalam 1000 ml aquadest, maka didapat larutan NaOH 0,1 N
v
Membuat larutan parasetamol
1. Menimbang
100 mg parasetamol dan dilarutkan dalam 100 ml NaOH, maka didapat larutan
dengan konsentrasi 1000 ppm
2. Membuat
larutan dengan konsentrasi 100 ppm dengan melarutkan 10 ml larutan induk dalam
100 ml NaOH
3.
Membuat larutan dengan konsentrasi 4 ppm dengan
melarutkan 0,4 ml (larutan dengan konsentrasi 100 ppm) dalam 100 ml NaOH
4. Membuat
larutan dengan konsentrasi 6 ppm dengan melarutkan 0,6 ml (larutan dengan
konsentrasi 100 ppm) dalam 100 ml NaOH
5. Membuat
larutan dengan konsentrasi 8 ppm dengan melarutkan 0,8 ml (larutan dengan
konsentrasi 100 ppm) dalam 100 ml NaOH
6. Membuat
larutan dengan konsentrasi 10 ppm dengan melarutkan 1 ml (larutan dengan
konsentrasi 100 ppm) dalam 100 ml NaOH
7. Membuat
larutan dengan konsentrasi 12 ppm dengan melarutkan 1,2 ml (larutan dengan
konsentrasi 100 ppm) dalam 100 ml NaOH
VI.
Pembahasan
Pada percobaan kali ini dilakukan pembuatan kalibrasi dari larutan uji
parasetamol, yang diawali dengan
pembuatan larutan NaOH 0,1N. Larutan ini digunakan sebagai pelarut parasetamol
karena parasetamol sukar larut dalam air.
Adapun tujuan kalibrasi adalah untuk mencapai
ketertelusuran pengukuran. Hasil pengukuran dapat dikaitkan atau ditelusur
sampai ke standar yang lebih teliti atau tinggi (standar primer nasional atau
internasional) melalui rangkaian perbandingan yang tidak terputus, dalam artian
standar ukur itu akan lebih baik apabila berupa standar yang rantainya
mendekati SI sehingga tingkat ketidakpastian (error) makin kecil.
Manfaat kalibrasi adalah sebagai berikut :
b. Untuk
mendukung sistem mutu yang diterapkan diberbagai industri pada peralatan
laboratorium dan produksi yang dimiliki.
c. Mengetahui
seberapa jauh perbedaan (penyimpangan) antara harga yang benar dengan harga
yang ditunjukkan oleh alat ukur.
Prinsip-prinsip dasar kalibrasi adalah sebagai berikut :
·
Obyek ukur (Unit Under Test)
·
Standar ukur, alat standar kalibrasi, prosedur
atau metode standar yang mengacu pada standar kalibrasi internasional atau
prosedur yang dikembangkan sendiri oleh laboratorium yang sudah terujui
(diversifikasi).
·
Operator atau teknisi, dipersyaratkan mempunyai
kemampuan teknik kalibrasi (bersertifikat).
·
Lingkungan yang dikondisikan, suhu dan
kelembaban selalu dikontrol, gangguan dari faktor lingkungan luar selau
diminimalkan (sumber ketidakpastian pengukuran).
Mulanya dibuat larutan induk parasetamol 1000 ppm yang kemudian larutan
ini di encerkan hingga 10 ppm dengan menggunakan pelarut NaOH. Tujuan dari
pengenceran ini adalah untuk mengetahui absorbansi dari larutan parasetamol
yang akan di uji. Setelah dilakukan uji spekrofotometer didapat absorbansi dari
larutan parasetamol 0,6 untuk 10 ppm. Dari absorbansi ini dapat diperoleh
absorptivitas molar 0,06 . Tujuan pengujian larutan parasetamol di awal ini merupakan
suatu simulasi yang mana dimaksudkan untuk mengetahui berapa konsentrasi
parasetamol yang akan di uji. Berdasarkan literatur absorbansi terbaik suatu
larutan berkisar rentang nilai 0,2 hingga 0,8.
Sehingga dengan menggunakan persamaan A = ε . b . c didapat konsentrasi terbaik berkisar 3,33 ppm
hingga 13,33 ppm.
Dari nilai konsentrasi yang diperoleh baru dapat dilakukan pembuatan
kurva kalibrasi. Larutan parasetamol yang di uji dibuat dalam konsentrasi 4 ppm,
6 ppm, 8 ppm, 10 ppm, 12 ppm. Nilai regresi yang diperoleh adalah 0,9955.
Sedangkan nilai regresi yang baik adalah mendekati 1 karena kesalahan inilah
yang menyebabkan garis kurva kalibrasi tidak linear ( garis lurus ). Namun
hasil ini tidak terlalu jauh dari literatur yang ada, sehingga masih dapat
digunakan sebagai acuan.
Berdasarkan hasil percobaan yang
telah dilakukan, didapat panjang gelombang dari larutan parasetamol adalah
256,5 nm. Sedangkan panjang gelombang larutan parasetamol berdasarkan literatur
adalah 257 nm. Kesulitan-kesulitan saat melakukan percobaan pun kerap kali
terjadi sehingga untuk memperoleh hasil yang baik, percobaan dilakukan
berulang-ulang.
Penyimpangan-penyimpangan tersebut mungkin disebabkan oleh:
·
Masih adanya zat pengotor dari larutan tersebut.
Pengotor seperti pencucian alat yang tidak
bersih dimungkinkan membawa dampak terhadap hasil yang diperoleh dari percobaan
ini.
·
Kekurangtelitian dari praktikan.
Kurangnya Ketelitian praktikan dapat
memungkinkan perbedaan panjang gelombang yang diperoleh seperti kurang
telitinya dalam penimbangan bahan, pengambilan pelarut, maupun ketidak
homogenan dalam pengocokan.
VII.
Kesimpulan
Berdasarkan hasil percobaan yang telah dilakukan
diperoleh :
1.
Nilai panjang gelombang dari larutan uji
parasetamol adalah 256,5 nm.
2.
Nilai regresi dari kurva kalibrasi larutan
parasetamol adalah 0,9955.
3.
Adanya perbedaan yang diperoleh dengan literatur
yang ada kemungkinan disebabkan adanya zat pengotor dari larutan uji.
4.
Untuk absorbansi terbaik ( 0,2 hingga 0,8 )
larutan parasetamol berada pada konsentrasi 3,33 – 13,33 ppm.
5.
Pada uji konsentrasi larutan parasetamol 4 ppm,
6 ppm, 8 ppm, 10 ppm dan 12 ppm diperoleh nilai absorbansi yang baik yaitu
0,212 hingga 0,799.
VIII.
Daftar Pustaka
Departemen
Kesehatan republic Indonesia. 1979. Farmakope
Indonesia, edisi III . Jakarta : Badan Pengawas Obat dan Makanan.
Mansoor m. Amiji, beverly j.
Sandmann. 1993. Applied Physical Pharmacy.
Bosto: mc Graw Hill.
Martin, Alfred dkk. 1990. Farmasi Fisik. Jakarta: UI Press.
